生色底物法是采用含有酰胺链的生色底物来检测水蛭素的活性，凝血酶能使酰胺键断裂释放对硝基苯胺，该类物质能在405nm处产生生色效应。显色深浅与凝血酶含量呈正相关。
该方法是利用水蛭素对凝血酶的抑制作用，降低了凝血酶水解发色底物的能力，从而降低生色效应，通过检测剩余凝血酶活力，计算出水蛭素的活力。该实验的主要方法是在25℃下，将凝血酶依照活力浓度由低到高的顺序与生色底物保温反应5分钟，加入33%醋酸0.5mL终止反应，在405nm波长处测定光吸收，建立以凝血酶活力值为横坐标，吸光度为纵坐标的标准曲线。然后将5μL凝血酶（8U·mL－1）和10~20μL的待测水蛭素样品加入到的0.1mo1·L－1 Tris－HCl（pH8.3）－0.2mo1·L－lNaC1缓冲液1mL中，于25℃下保温5分钟，然后再加入生色底物（Chromozym，TH，1.5mmol·L－1）125μL，继续在25℃下保温5分钟，加入33%醋酸⒐5mL终止反应，于405nm波长处测定光吸收，查标准曲线，得到与水蛭素反应后剩余凝血酶活性，用凝血酶活力值－剩余凝血酶活力值即可计算出水蛭素的活性。此过程中随着水蛭素浓度的增加，水蛭素对凝血酶的抑制作用也增大，剩余凝血酶活力逐渐降低，最终趋于平缓。
此法的优点是适用浓度范围广，结果准确，重复性高，适合体内和体外检测，但是生色底物需要进口，价格昂贵，从而限制了此种方法的广泛应用。
