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水蛭素生物活性测定法之生色底物法

生色底物法是采用含有酰胺链的生色底物来检测水蛭素的活性,凝血酶能使酰胺键断裂释放对硝基苯胺,该类物质能在405nm处产生生色效应。显色深浅与凝血酶含量呈正相关。

该方法是利用水蛭素对凝血酶的抑制作用,降低了凝血酶水解发色底物的能力,从而降低生色效应,通过检测剩余凝血酶活力,计算出水蛭素的活力。该实验的主要方法是在25℃下,将凝血酶依照活力浓度由低到高的顺序与生色底物保温反应5分钟,加入33%醋酸0.5mL终止反应,在405nm波长处测定光吸收,建立以凝血酶活力值为横坐标,吸光度为纵坐标的标准曲线。然后将5μL凝血酶(8U·mL-1)和10~20μL的待测水蛭素样品加入到的0.1mo1·L-1 Tris-HCl(pH8.3)-0.2mo1·L-lNaC1缓冲液1mL中,于25℃下保温5分钟,然后再加入生色底物(Chromozym,TH,1.5mmol·L-1)125μL,继续在25℃下保温5分钟,加入33%醋酸⒐5mL终止反应,于405nm波长处测定光吸收,查标准曲线,得到与水蛭素反应后剩余凝血酶活性,用凝血酶活力值-剩余凝血酶活力值即可计算出水蛭素的活性。此过程中随着水蛭素浓度的增加,水蛭素对凝血酶的抑制作用也增大,剩余凝血酶活力逐渐降低,最终趋于平缓。

此法的优点是适用浓度范围广,结果准确,重复性高,适合体内和体外检测,但是生色底物需要进口,价格昂贵,从而限制了此种方法的广泛应用。

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