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水蛭素生物活性测定法之光散射法

纤维蛋白是不溶于水的蛋白质,纤维蛋白原在凝血酶的作用下,切去纤维肽A和B,转变为纤维蛋白并产生凝集,这一过程会导致反应体系的光散射强度发生变化。光散射法是依据光散射强度发生变化建立的。

原理:用纤维蛋白原作底物,加入一定量的凝血酶,检测在480nm处光散射强度的变化,在一定浓度的纤维蛋白原溶液中,光散射强度的变化速度与加入的凝血酶的量成正比,在一定的纤维蛋白原和凝血酶的浓度下,加入水蛭素,会降低光散射强度的增加速度,且加入量与光散射强度变化成反比。

光散射法的主要方法是先建立水蛭素标准曲线,即把含有血纤维蛋白原(终浓度1.2μmol-1·L-1)和标准水蛭素(终浓度0~23μmol·L-1)0.05mol·L-1Tris-HCl(pH7.2)NaCl缓冲液2mL,在25℃下保温8分钟,然后再加入凝血酶,立即在25℃测定光散射10分钟。根据最大斜率处每分钟光散射强度变化值作为活性计算依据。用最大斜率处每分钟光散射强度变化值,对水蛭素浓度做一元线性回归图,得到水蛭素标准曲线。用待测水蛭素代替以上的标准水蛭素,在480nm处测光散射值,查标准曲线,即可得到相应的抗凝活性值。该方法的相关系数为0.994。

该方法的优点是提高了准确性、操作简便,同时可以观察反应动力学曲线。但光散射仪价格较贵,不具有普遍适用性,目前较少应用。

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