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水蛭素免疫测定法

免疫测定法是把免疫学手段运用到水蛭素含量测定中,利用抗原抗体的高度特异性反应,选择合适的抗体和测定方法,可以快速、简便地检测水蛭素含量。

1.酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法的过程包括固相载体吸附抗体,加待测抗原,再与相应的酶标记抗体进行抗体抗原的特异免疫反应,生成抗体一待测抗原一酶标记抗体的复合物,最后再与该酶的底物反应生成有色产物,显色后在酶标仪上读取各孔45Onm处的吸光度值即可。
该方法特异性和灵敏度高,线性范围在0.08一78.45AT一U之间,试剂盒的出现使它成为水蛭素药动力学研究的优选方法。
美国ADI公司生产的试剂盒由专一性兔抗水蛭素多克隆抗体预包被96孔板和辣根过氧化物酶标记的小鼠抗水蛭素单克隆抗体组成,酶反应底物为3,3′,5,5’一四甲基联苯胺(TMB)。酶联免疫吸附测定法已被用于重组水蛭素在猕猴等的体内药动学研究。

2.放射免疫测定法

放射免疫测定法是将检测放射性的高灵敏度与抗体抗原结合反应的惊人的特异性结合在一起的微量分析法,用定量的放射性同位素标记抗原和变量的非放射性抗原共同与限量的抗体竞争。
原理:放射性标记抗原AG和未标记抗原(待测物)Ag与不足量的特异性抗体Ab竟争性结合,形成AG一Ab或Ag一Ab复合物。因为加入的AG和Ab的量是恒定的,当结合反应达到动态平衡后,若Ag量增多,生成的Ag一Ab量增多,AG一Ab生成量相对减少,游离的AG增多,即Ag与复合物的放射性成反比。反应达到平衡后,用有效的方法将AG一Ab和Ag一Ab复合物与游离的AG和Ag分离,测量其放射性,即可求得样品中抗原Ag的含量。
这种方法灵敏度高,最低检出限为10ng·mL-1。优点是高灵敏度和特异性、简便易行、用样量小。缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应,影响结果。

3.斑点免疫印迹法

应用斑点免疫印迹法对水水蛭炮制品中水蛭素做定性检测,基于水蛭素抗体对水蛭素的免疫识别作用,以鼠抗水蛭素单抗为一抗,与水蛭素在肖酸纤维素膜上做免疫杂交,经HRP标记的二抗催化底物ECL显色。免疫杂交图谱应用Quantity one软件对杂交斑点做轨迹定量扫描,应用轨迹定量法测定水蛭素的杂交信号。该方法先以标准抗原水蛭素浓度为横坐标,轨迹信号量为纵坐标,得回归方程Y=2.432X,r=0.9544。结果表明水蛭素的标准抗原与斑点轨迹信号量在0~16mg’L-1线性关系良好,精密度RSD为1.9%,稳定性RS为1.5%,重复性RS为3.9%。

这种检测方法具有高灵敏度和特异性,不需要大型仪器。

免疫学方法具有高灵敏度和特异性,但是高效价和高特异性的抗体是准确进行这些检测的前提,试剂盒的出现使水蛙素检测更加快速、便捷。但是抗体和抗原均需要在冰箱中保存,避免失活。

仅供学习研究参考:水蛭素研究网 » 水蛭素免疫测定法
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