传统提取天然水蛭素方法

3.黄仁槐等以湖南产日本医蛭吸血后经挤压法采集水蛭嗦囊内消化液作为原料,经三氯醋酸沉淀后除去大量杂蛋白、杂质,得到的粗提液直接用DEAE一纤维素柱层析一步纯化,收集到的活性峰成分再…

3.黄仁槐等以湖南产日本医蛭吸血后经挤压法采集水蛭嗦囊内消化液作为原料,经三氯醋酸沉淀后除去大量杂蛋白、杂质,得到的粗提液直接用DEAE一纤维素柱层析一步纯化,收集到的活性峰成分再经反相HPLC脱盐及进一步的纯化后即可获得批量的水蛭素。对纯化的水蛭素进行了SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳、质谱、N端顺序分析及抗凝血酶活性分析。其结果是:各步纯化活性回收率,酸沉淀步骤的为75%,阴离子交换柱层析及反相HPLC脱盐步骤的为58%,经测定所纯化的水蛭素的抗凝血酶活性为60AT一Umg;反相HPLC纯化所得水蛭素经SDS一PAGE分析,显示均一的一条带,证明所纯化样品为电泳纯,经测定其分子量约为8000道顿;测定了N端8个残基的序列,为ETYT0CTY。天然水蛭素具有多种异构体,由65一66个氨基酸残基组成,其N端肤链的1一39位残基常变化,可能有几个残基的更换与去除,其保守序列在C端。本研究从日本医蛭嗦囊消化液中纯化得到的水蛭素与从欧洲医蛭提取到PA一hirudin的N端序列ITYTOCTE只第一、八位不同,由于所用水蛭的种类不同,原料不同,N端主要序列相同,生物学活性相同,所以认为所纯化的样品为水蛭素;质谱测定其中主峰的质子抑电荷数为8634.61,从图谱中可看出样品纯度约有80%。从欧洲医蛭分离纯化到的水蛭素;圣子量约为6950道尔顿,而本研究所分离纯化到的水蛭素分子量为8000道尔顿,两者相差较大,这可能与材料来源不同,所提取到的水蛭素分子结构差异有关。

4.段超等采用仿生诱导的方法即利用猪血+田螺联合的诱导体系在25℃,PH=7.2下对活体水蛭进行诱导,使其分泌唾液。利用超滤技术对水蛭唾液进行决速膜分离,再经离子交换层析和凝胶过滤层析进行中间纯化,最后利用HPLC进行分离纯化得到高纯度的水蛭素。

结果:经过分离纯化可得到纯度为92%的水蛭素。

结论:仿生诱导水蛭素的方法简便可行,同时利用物理方法一一超滤分离目标物质,作为水蛭素的粗级分离不合化学试剂,为水蛭素的后期分离减少了不少麻烦,对水蛭素的纯度也提供了保障,为水蛭的持续利用提供了新的思路,既保护了水蛭的资源,也为水蛭素的产业化提供了理论依据。

5.杨谨等将提取到的日本医蛭唾液腺分泌物,置冰箱中冷冻保存待用。解冻后取250一300mL加进4倍置冰箱中4℃下预冷的含15%水的冷丙酮,搅拌后置冰箱中4℃下让其沉淀过夜,次日吸出上清丙酮并离心,在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸(约25mL)使其溶解,离心除去残渣,取上样进行柱层析,然后取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂(DEAE一C52)加蒸馏水使其膨胀,按常规方去衣次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCI及0.5mol/L的NaOH一NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸馏水洗涤至中性。装柱(2cmx60cm)至所需高度,用pH=4.6的0.lmol/枸橼酸钠缓冲液平衡;用5mL的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线,分段收集洗脱液,流速为30mL/小时。经检测将有部分集中于透析袋中用甘油浓缩,得到浓缩液后,先用双缩脲法测定总蛋白质含量,其结果是从日本医蛭唾液腺分泌物提取液纯化总得率为15%,纯化后的产物的抗凝活性为67O8ATU/mg蛋白;接着取适量的交联葡聚糖离子交换剂(Sephadex一G25)加蒸馏水浸泡4小时,按常规方法用0.5mol/L NaOHNaCI混合液浸泡半小时,抽滤除去碱液并用蒸馏水洗涤至中性,加热煮沸除去气泡,装柱(1.5cm*50cm)至所需高度,用PH=7.4的0.1mol/L Tris一HCl一NaCI缓冲液平衡,取上述浓缩液上样,洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线,分段收集洗脱液,流速为90mL/小时。分别检测抗凝活性,将有抗凝活性部分集中于透析袋中用甘油浓缩。经检测抗凝活性后,用DU一70贝克曼分光光度计在200~400nm波长范围内扫描,便能确定所得产物的纯度。采用凝血酶滴定法检测水蛭素的含量,测定结果表明日本医蛭唾液腺分泌物提取液中水蛭素的含量为4AT一U/mL。

水蛭素研究网

作者: 水蛭素研究网

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